Let-7c慢病毒载体对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.01.004

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (1): 20-25.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.01.004

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Let-7c慢病毒载体对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞的影响

王静，赵绍云，李明哲，景黎君，焦淑洁，彭涛，滕军放，贾延劼

郑州大学第一附属医院神经内科，河南省郑州市 450052

收稿日期:2015-11-30 出版日期:2016-01-01 发布日期:2016-01-01
通讯作者: 贾延劼，博士后，主任医师，郑州大学第一附属医院神经内科，河南省郑州市 450052
作者简介:王静，女，1990年生，河南省淅川县人，汉族，2016年郑州大学毕业，硕士，主要从事干细胞在神经系统疾病中的应用研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(骨髓间充质干细胞神经命运决定中的自噬现象及其mTOR信号通路的作用/ 81071114；Lin28/let-7调控的骨髓间充质干细胞移植治疗阿尔兹海默病的实验研究/81371385)

Effect of Let-7c on neural differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

Wang Jing, Zhao Shao-yun, Li Ming-zhe, Jing Li-jun, Jiao Shu-jie, Peng Tao, Teng Jun-fang, Jia Yan-jie

Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China

Received:2015-11-30 Online:2016-01-01 Published:2016-01-01
Contact: Jia Yan-jie, M.D., Chief physician, Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
About author:Wang Jing, Master, Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81071114, 81371385

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

微小RNA：是一类内源性的长20-25个核苷酸的非编码RNA，通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达，进而参与骨髓间充质干细胞的重要生物学进程，包括发育、细胞增殖、分化、凋亡等多种过程。

慢病毒载体：是目前分子及细胞生物实验中非常有效的工具，在基因转染方面有着许多独特的优势，可将其携带的外源基因整合到宿主基因组，保证转基因长期稳定表达，且不编码病毒蛋白，并在中枢神经系统中不会引起免疫反应。

背景：微小RNA参与调控干细胞增殖、分化、衰老等过程，通过了解Let-7家族成员Let-7c对骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响可以为干细胞移植治疗提供新思路。

目的：探讨Let-7c慢病毒载体在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。

方法：构建Let-7c上调及下调慢病毒载体并体外转染大鼠骨髓间充质干细胞，筛选最适转染复数；实验分为未转染组、阴性转染组(转染空白慢病毒)、转染上调组(转染LV-rno-Let-7c-up)、转染下调组(转染LV-rno-Let-7c-5p-inhibition)；采用法舒地尔诱导转染后的大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞，倒置荧光显微镜下观察骨髓间充质干细胞转染后荧光表达，免疫细胞化学染色检测神经元标记物NSE和MAP-2的表达，RT-PCR检测MAP-2 mRNA的表达，MTT法检测细胞存活率。

结果与结论：倒置荧光显微镜下观察大鼠LV-rno-Let-7c-up和LV-rno-Let-7c-5p- inhibition慢病毒载体转染成功。法舒地尔可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞，与阴性转染组相比，转染上调组的诱导效率升高(P < 0.05)，NSE和MAP-2表达率上升(P < 0.05)，转染下调组的诱导效率下降，NSE和MAP-2表达率下降(P < 0.05)。转染LV-rno-Let-7c-up后骨髓间充质干细胞经法舒地尔诱导向神经细胞分化比率增加，Let-7c可能具有促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-4739-8143(王静)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, let-7c, 神经元, 慢病毒, 转染, 神经分化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The microRNAs are involved in regulation of stem cell proliferation, differentiation and aging. To study the effect of Let-7c, a member of Let-7, on the neural differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells provides new ideas for stem cell therapy.

OBJECTIVE: To investigate the role of Let-7c in the neural differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

METHODS: The lentiviral vectors of Let-7c-up and Let-7c-inhibition were constructed and transfected into rat bone marrow mesenchymal stem cells. Optimal multiplicity of infection was screened. The cells were divided into non-transfected group, negative control group (transfected with empty virus), transfected enhancement group (transfected with LV-rno-Let-7c-up), transfected inhibition group (transfected with LV-rno-Let-7c-5p-inhibition). Bone marrow mesenchymal stem cells were treated with fasudil as an inducer for triggering the cells to differentiate into neurons. The fluorescence expressed by transfected cells was observed under inverted fluorescence microscope. The expression of neuron-specific markers, neuron-specific enolase and microtubule-associated protein 2, were measured by immunocytochemical method. The mRNA expression of microtubule-associated protein 2 was detected by RT-PCR. The cell viability was determined by MTT method.

RESULTS AND CONCLUSION: Under the inverted fluorescence microscope, the cells were successfully transfected with LV-rno-Let-7c-up and LV-rno-Let-7c-5p-inhibition. Fasudil induced bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into neurons. The transfection efficiency and expression levels of neuron-specific enolase and microtubule-associated protein 2 in the transfected enhancement group were significantly higher than those in the negative control group (P < 0.05), while in the transfected inhibition group, they were lower than those in the negative control group (P < 0.05). These findings indicate that the differentiation percentage of bone marrow mesenchymal stem cells is increased by fasudil after transfection with LV-rno-Let-7c-up, and Let-7c may promote the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neurons.

中图分类号:

R394.2

王静，赵绍云，李明哲，景黎君，焦淑洁，彭涛，滕军放，贾延劼. Let-7c慢病毒载体对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(1): 20-25.

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引言

材料方法

1.1 设计体外实验。

1.2 时间及地点实验于2014年12月至2015年8月在郑州大学第一附属医院重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级SD大鼠2只，雌雄不限，6-8周龄，体质量100-120 g，由河南省实验动物中心提供，许可证号为SCXK(豫)2010-0002。研究中所有动物的使用均经过郑州大学动物保护委员会同意。骨髓间充质干细胞从大鼠股骨和胫骨骨髓中分离提取，连续传6代以上。

1.3.2 主要试剂 Age Ⅰ、EcoR Ⅰ和T₄DNA ligase (NEB)，病毒包装三质粒：GV重组载体系列(同时可表达绿色荧光蛋白)和pHelper 1.0和pHelper 2.0(上海吉凯基因化学有限公司)，胎牛血清和DMEM高糖培养基(美国Gbico公司)，神经元烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE，bs-1027R)和神经微管结合蛋白(microtubule-associated protein 2)兔抗小鼠多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，Cy3标记山羊抗兔IgG(H+L)(上海碧云天公司)，RNA提取试剂盒(康为)，RT-PCR试剂盒(Oligo公司)，L-多聚赖氨酸和噻唑蓝(美国Sigma公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞分离、纯化及扩增取SD大鼠根据动物实验的相关规定，颈椎脱臼处死后，置体积分数为75%乙醇中浸泡5 min，无菌条件下分离大鼠双侧股骨和胫骨，暴露出骨髓腔，以含体积分数为10%胎牛血清的 DMEM培养基缓慢反复冲洗骨髓腔直至发白，收集骨髓液移至离心管中，1 500 r/min离心3 min，弃上清，以培养基重悬细胞，制成单细胞悬液，以1×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于25 cm²的无菌培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂的恒温培养箱内培养，48 h半量换液，96 h后完全换液，之后每3 d换液1次，倒置显微镜动态观察骨髓间充质干细胞生长情况，待贴壁细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白+0.04%EDTA消化传代至6代以上备用。

1.4.2 Let-7c慢病毒载体的构建根据miRBase数据库获得Let-7c(MIMAT0000776)序列，合成双链DNA oligo和Pfu-GW-iRNA载体，再将双酶切慢病毒载体和克隆好的双链DNA oligo进行链接；构建后的pGC-LV载体与慢病毒包装质粒载体pHelper 1.0、pHelper 2.0通过Lipofectamine 2000共转染至293T包装细胞，产生病毒液并采用孔稀法测定滴度。最后将制备好的慢病毒载体放至-80 ℃冰箱冻存备用。

1.4.3 转染复数值测定取培养6代以上的大鼠骨髓间充质干细胞，以1×10⁵/孔的密度接种至24孔板。培养两三天，直至细胞融合度达50%左右，按5个不同的转染复数值 (1，10，20，50，100)添加病毒液和终质量浓度为5 mg/L的Polybrene。阴性转染组只添加含有EGFP的空病毒上清，转染上调组添加let-7c慢病毒载体上清和EGFP，转染下调组添加let-7c-inhibition慢病毒载体上清和EGFP，终质量浓度为5 mg/L的Polybrane被添加到以上3组中，而未转染组不做处理。共转染12 h后更换新鲜培养基。转染后每天在倒置荧光显微镜下观察各组细胞绿色荧光蛋白表达情况，评估转染效率，筛选最适转染复数值。

1.4.4 大鼠骨髓间充质干细胞转染及实验分组根据转染情况将同时点的骨髓间充质干细胞分为4组：未转染组(不进行转染，其他培养条件同各转染组)，阴性转染组(转染空白慢病毒，只含EGFP)，转染上调组(转染LV-rno-Let-7c-up，含Let-7c-up 慢病毒和EGFP)，转染下调组(转染LV-rno-Let-7c-5p-inhibition，含Let-7c-inhibition慢病毒和EGFP)，每组设3个重复孔。在倒置荧光显微镜下观察转染24，48，72 h和4，5，6，7 d EGFP荧光表达情况，评价细胞转染效率。

1.4.5 体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞取各组细胞进行诱导实验，弃去DMEM完全培养基，用PBS洗3次，加入含有法舒地尔(终浓度为200 μmol/L)的DMEM完全培养基，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱内2 h。倒置荧光显微镜下观察30 min，1 h，2 h细胞形态变化。

1.4.6 MTT比色法将转染LV-rno-let-7c-up、LV-rno-let- 7c-inhibition和空白慢病毒各时点的骨髓间充质干细胞移入96孔培养板，每孔加入MTT(5.0 g/L)50 μL，置于培养箱孵育4 h，离心弃上清，加入二甲基亚砜200 μL，采用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度，评价细胞存活率。

1.4.7 免疫细胞化学染色法各组细胞经PBS清洗后用40 g/L多聚甲醛固定于4 ℃过夜，用0.2%TritonX-100处理10 min，用封闭液封闭1 h后去除封闭液，然后分别用NSE抗体(1.0 mg/L)、MAP-2抗体(1.0 mg/L)在4 ℃条件下孵育24 h。PBS清洗3遍后，于室温下用Cy3标记山羊抗兔IgG(1∶500)进行染色标记，通过倒置荧光显微镜(用×10或×20)摄取细胞图像，选取明视野下细胞数尽量相同的图像，每组采集超过30个区域的细胞，应用ImagePro Plus 6.0专业图像分析软件分析各实验组荧光图片单个细胞的累积吸光度值，进行统计学分析。

1.4.8 RT-PCR 采用康为试剂盒分离纯化各组细胞的总RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度。参照oligo试剂盒实验操作说明进行RT-PCR，总反应体积　20 μL，然后取RT-PCR产物10.0 μL，加上样缓冲液2.0 μL，在2%琼脂糖凝胶上电泳，70 V 40 min，凝胶图像成像系统拍摄保存实验结果，凝胶图像分析系统(GelProAnalyzer 3.0)分析各目的基因与β-actin基因条带吸光度值。

1.5 主要观察指标细胞转染效率，法舒地尔诱导后细胞形态变化及神经元标记物NSE及MAP-2的表达情况。

1.6 统计学分析用统计软件SPSS 19.0进行数据分析，实验数据以x(_)±s表示，用单因素方差分析(ANOVA)进行2组以上的组间比较，最小显著性差异(LSD法)进行组间两两比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞可塑性强，不仅可以分化为中胚层细胞，还能打破胚层障碍在特定条件下分化为外胚层神经细胞^[3^，^16-17]，同时具有获取方便、扩增迅速、可定向诱导分化、低免疫原性、可对其进行基因工程技术加工等优点，已被视为神经系统疾病细胞和基因治疗的理想种子细胞^[18]。

慢病毒载体包容性大，可感染多种类型细胞，将其携带的外源基因整合到宿主基因组，保证转基因长期稳定表达，且不编码病毒蛋白，并在中枢神经系统中不会引起免疫反应^[19]。Greco等^[20]发现miRNAs在人骨髓间充质干细胞分化为神经细胞过程中起着重要调控作用。Let-7家族成员主要在成人的胚胎及脑组织内高度表达，在神经干细胞也是上调表达的^[21]。许多研究表明Let-7可能通过多种方式参与Notch、Wnt、PI3K/Akt/mTOR、Ras-ERK/MAPK等信号通路进而参与间充质干细胞神经分化过程^[22-24]。据此该研究采用三质粒表达系统即pGC-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体来构建慢病毒载体，建立Let-7c增强及抑制体外模型，为探讨其在骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞中的作用提供依据。

研究利用Let-7c上调和下调慢病毒载体转染骨髓间充质干细胞，并观察其在骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞中的作用。结果发现：①Let-7c上调及下调慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞后，EGFP可以稳定表达，转染效率高。②转染慢病毒载体后的细胞存活率与未转染组相比显著下降，提示慢病毒载体可能影响细胞存活率，但各转染组即阴性转染组、转染上调组和转染下调组之间细胞存活率无明显差异，因此可以转染空白慢病毒作为对照以实现阴性对照，这也提示Let-7c可能对骨髓间充质质干细胞存活率影响不大，有待进一步的实验来验证。③骨髓间充质干细胞在法舒地尔诱导30 min后细胞开始出现胞体收缩，细胞间隙增宽，诱导2 h后细胞的胞体收缩成锥形或圆形，折光性强，有较多的长突起，分支增多，交织成网状，其机制为ROCK抑制剂法舒地尔通过抑制Rho激酶活性，从而调控细胞骨架重建，启动细胞分化过程，同时通过干扰ROCK信号通路与其他信号传导通路之间本来相对平衡稳定的内环境，关闭或激活下游途径中与细胞分化相关的基因，从而促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化^[25]。④与阴性对照组比较，转染上调组骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的效率明显增高，神经细胞早、中期标志物NSE及成熟神经元特异性标志物MAP-2表达增高显著，而转染下调组骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的效率下降，NSE和MAP-2的表达下降。这提示Let-7c可能在骨髓间充质干细胞横向分化为神经细胞中发挥重要作用，提高Let-7c的表达可使骨髓间充质干细胞更容易向神经细胞分化，而抑制Let-7c的表达则不利于其向神经细胞分化。

Let-7c影响骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的机制尚不清楚，有研究证实let-7c可以靶向调控RAS信号通路，通过与RAS的3’-UTR相应位点结合对Ras-ERK/MAPK进行负性调控^[24]，而Ras-ERK/MAPK信号通路在骨髓间充质干细胞神经分化过程中起重要作用^[26]，因此let-7c可能通过Ras-ERK/MAPK信号通路影响骨髓间充质干细胞的神经分化。体外诱导骨髓间充质干细胞神经分化过程还涉及Notch信号通路，通过抑制Notch1可提高分化效率^[27]；有研究发现Notch1高表达时检测let-7c表达减低^[28]，提示let-7c可能参与调控Notch1表达，而且根据靶基因检索(mirbase)发现大鼠let-7c靶基因中包含Notch1，因此推断let-7c可能通过抑制Notch信号通路来影响骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化，具体机制需要进一步实验证明。

综上所述，研究发现let-7c可以增加骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的效率，提示Let-7c在骨髓间充质干细胞神经分化过程中可能起促进作用。

Let-7c慢病毒载体对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞的影响

Effect of Let-7c on neural differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

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